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熒光淬滅問題的改善方案
來源:技術(shù)文章    更新時間:2024-10-09    瀏覽:396次

熒光成像為生命科學(xué)研究帶來了無限可能,從寬場熒光到共聚焦,再到超分辨,我們觀察的精度不斷提升,但一個問題始終存在——熒光淬滅今天我們來看看《自然》雜志的工具論文,“走向更亮更耐光的熒光團(tuán)",了解下更耐光的熒光團(tuán)是怎么煉成的。

一、熒光淬滅是什么?

先定義下熒光淬滅。熒光淬滅或者通俗點叫“褪色",泛指降低熒光團(tuán)熒光強度的所有過程

①大致可以分為四種:

1、化合物形成complex formation

熒光淬滅問題的改善方案


化合物形成淬滅

熒光物質(zhì)分子與外部分子/離子反應(yīng)形成非熒光化合物,常見的熒光淬滅就是高光強下氧化形成新的化合物這種現(xiàn)象也叫光漂白photo bleaching,是不可逆的破壞。

2、能量轉(zhuǎn)移energy transfer

熒光淬滅問題的改善方案FRET藍(lán)熒光轉(zhuǎn)移成黃熒光

顧名思義,能量出現(xiàn)了從供體到受體的轉(zhuǎn)移,如果受體不產(chǎn)生熒光,那熒光就熄滅了;如果受體產(chǎn)生熒光,就會出現(xiàn)受體熒光和次級熒光光譜紅移,這就是熒光共振能量轉(zhuǎn)移FRET.

3、激發(fā)態(tài)反應(yīng)excited state reactions

熒光淬滅問題的改善方案ESIPT激發(fā)態(tài)分子內(nèi)質(zhì)子轉(zhuǎn)移②

激發(fā)態(tài)高能量下熒光團(tuán)化學(xué)結(jié)構(gòu)出現(xiàn)結(jié)構(gòu)破壞,改變熒光特性,這種現(xiàn)象稱為激發(fā)態(tài)分子內(nèi)質(zhì)子轉(zhuǎn)移ESIPT,可以理解為2的質(zhì)子轉(zhuǎn)移版本。

4、濃度淬滅collisional quenching

熒光淬滅問題的改善方案

聚集誘導(dǎo)淬滅ACQ和聚集誘導(dǎo)熒光AIE

熒光分子聚集或距離過近導(dǎo)致互相干擾,非輻射衰減概率增大,使發(fā)光效率下降這種現(xiàn)象稱為聚集誘導(dǎo)淬滅ACQ。有些熒光團(tuán)反過來是在聚集態(tài)才會增強熒光,這種現(xiàn)象就是聚集誘導(dǎo)熒光發(fā)光AIE.

二、三種改造熒光團(tuán)的嘗試

熒光發(fā)光原理

熒光團(tuán)在激發(fā)態(tài)回到正常態(tài)需要釋放能量,要么發(fā)出熒光釋放,要么以震動等形式非輻射衰減釋放。理論上,減少非輻射衰減的比例,就能提升熒光釋放比例,以此獲得更高光強、更長的熒光壽命。

1、加固蛋白結(jié)構(gòu)的mCherry

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mCherry的結(jié)構(gòu)渲染圖,外層螺旋是β-桶結(jié)構(gòu)

通過改變熒光蛋白的蛋白支架結(jié)構(gòu),使其更穩(wěn)定,從而提升熒光強度,延長熒光壽命,比如“加固"mCherry的β-桶結(jié)構(gòu),防止發(fā)色團(tuán)的分子重,可以減少非輻射衰減,得到的mCherry-XL mScarlet3 都比mCherry更亮更耐光。

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mScarlet3亮度是mCherry 5倍左右,壽命3倍以上

2、關(guān)閉非輻射衰減的EGFP

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EGFP標(biāo)記的斑馬魚,MZX81拍攝

通過模擬計算,科學(xué)家發(fā)現(xiàn)EGFP存在的一個非輻射途徑是電子從發(fā)色團(tuán)轉(zhuǎn)移到酪氨酸殘基上,從而改變了熒光特性。把酪氨酸換成亮氨酸,可以阻斷這個非輻射途徑,成功將EGFP的耐光性提升80可惜這種EGFP的亮度受到了負(fù)面影響,變暗了,因此在生物領(lǐng)域可能用不上。

3、改良工藝的羅丹明系列染料

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Janelia Fluor對比傳統(tǒng)染料

羅丹明是Texas RedROXTAMRA等染料的基礎(chǔ)成分,傳統(tǒng)合成工藝在試劑環(huán)境、精度控制等方面存在局限,有科學(xué)家成功以更現(xiàn)代化的合成工藝對其進(jìn)行改良,在烷基氨基取代基中引入氘原子,改變了關(guān)鍵分子尺寸,從而減少了非輻射衰減。這形成的就是Janelia Fluor系列熒光染料,覆蓋從綠色到紅色熒光光譜,可以提供倍于傳統(tǒng)熒光染料的熒光光強和熒光壽命。

三、如何更好地使用這些改良的熒光團(tuán)?

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mCherry-XL激發(fā)峰在Y波段

熒光團(tuán)改良后,不僅熒光強度更高、熒光壽命更長,其激發(fā)發(fā)射屬性也可能發(fā)生變化。比如mCherry-XLmScarlet3,它們需要使用Y通道激發(fā),而不是原版mCherryR通道激發(fā)。

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MF43-N可升級Y激發(fā)塊支持mCherry-XLmScarlet3

MF43-NMF53-N可以通過安裝Y激發(fā)塊/G2激發(fā)塊支持mCherry-XLmScarlet3,而其他顯微鏡可以選擇帶Y通道的數(shù)顯熒光模塊實現(xiàn)支持。

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更亮更耐光的熒光團(tuán)更適合dSTORM超分辨成像

但這些更亮更耐光的熒光團(tuán)更大價值在于適用于更高要求的成像,比如共聚焦和超分辨熒光成像。使用MF53-TIRF升級成dSTORM成像時,需要搭配高亮度、高耐光的熒光染料,才能獲得更高信噪比的成像。而在一些神經(jīng)學(xué)實驗中,已經(jīng)有科學(xué)家利用這些新型染料,實現(xiàn)了對腦神經(jīng)毫秒級的電信號變化進(jìn)行熒光標(biāo)記成像,從而更深入揭示神經(jīng)元信息處理和學(xué)習(xí)的機制。

Lakowicz, J.R. (1983). Quenching of Fluorescence. In: Principles of Fluorescence Spectroscopy. Springer, Boston, MA. https://doi.org/10.1007/978-1-4615-7658-7_9

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